肝细胞癌（HCC）患者将肿瘤细胞释放到血流中，可以使用细胞表面标志物检测。尽管有许多报道表明循环肿瘤细胞（CTC）数量与不良临床结果之间存在直接关联，但很少有研究提供CTC的全面分子表征。由于在HCC晚期患者中获取组织样本的机会有限，因此开发新技术以在常规临床条件下鉴定HCC癌症驱动因素至关重要。在这里，研究人员描述了一种方法，顺序结合图像流式细胞仪和高密度单细胞mRNA测序，以识别HCC患者的CTC。使用该方法对CTC进行基因组广泛表达分析证明了CTC异质性并且有助于检测HCC中已知的致癌驱动因子，例如IGF2。
　　 液体活检的概念，需要分析释放到血液中的肿瘤成分（即DNA和肝癌晚期肿瘤细胞），已经彻底改变了肿瘤学。液体活检的主要优点是：（1）该技术具有微创性，可降低组织活检的财务成本和潜在并发症，（2）在患者随访期间易于迭代。考虑到癌细胞如何适应药理学压力，并获得在基线未检测到的新分子改变，这两个特征都是至关重要的。为了解释这一点，研究人员要在每次治疗时进行重复的侵入性组织活检，这在常规临床条件下难以实施。因此，使用液体活检策略开发新的生物标志物是必要的。这在肝细胞癌（HCC）中甚至更为关键，因为这些患者通常使用成像技术诊断，因此与大多数实体肿瘤不同，进入组织以在HCC中进行生物标志物研究要困难得多。在美国，肝癌晚期（HCC包括和肝内胆管癌两者）是目前无论是在发生率和死亡率方面增长最快的恶性肿瘤。大多数在HCC中探索循环肝癌晚期肿瘤细胞（CTC）的研究表明，较高的CTC数量和较差的临床结果之间存在直接关联。在大多数情况下，CTC检测依赖于少量表面标记的分析。实际上，唯一经FDA批准的检测CTC的装置是基于表面标志物EPCAM的表达。这些方法不包括分离CTC以进行更高分辨率的分子表征，这对于使用CTC分析作为询问显性肿瘤分子改变的代理是至关重要的。最近在CTC使用全基因组测序（WGS）在转移性乳腺癌患者中显示了这一概念，这允许检测CTC隔室中已知的驱动突变。类似地，从患有转移性前列腺癌的患者中分离的CTC的WGS揭示了可以追踪到相应肿瘤组织的驱动突变。
　　 关于使用单细胞技术的CTC的全基因组转录组分析的数据很少。这是由于单细胞分离技术的相对低通量，其允许并行排列相对较少数量的细胞。考虑到血液中CTC的稀有性（估计7,000,000个有核细胞中的0-10个CTC），在单细胞测序之前需要对CTC进行广泛富集。使用scRNAseq分析的CTC研究利用不同的方法来分离的CTC使用机器人或微流体装置。CTC的隔离在很大程度上依赖于特定的标记物，例如在前列腺癌或NG2的EpCAM的识别在黑素瘤。这些研究证实了分离的CTC的全基因组表达分析能够检测组织对应物中发现的基因的去调节的能力。其他CTC分离方法，如基于细胞表面波形蛋白表达的方法，可以将PD-L1鉴定为结肠直肠癌或前列腺癌患者的预后标志物。替代方法有利于使用基于PCR的技术来获得分析有限数量基因的CTC表达特征，如最近在HCC所示。
　　 由于血液中CTC的稀有性，研究人员调整了分析scRNAseq管道以特别敏感地检测异常值。研究人员分别对患者1和2中的7,104和3,130个细胞进行了测序。患者1中每个细胞检测到的RNA分子和基因的中位数为3,046（范围1,004-21,169）和1,098（范围202-4,109）。在患者2中，研究人员检测到每个细胞中值为2,552个RNA分子（范围1,147-27,950）和933个基因（范围202-4,484）。研究人员使用变量最大的基因来计算数据集中变异性的主要来源，如主成分（PC）分析所示。该方法鉴定了来自患者1的两个CTC和来自患者2的一个CTC，其基因表达谱与血液中的其他克隆群体显着不同。这些候选CTC沿着第一台PC对齐，强调了该PC捕获的强大变异来源。在这两种情况下，定义PC1的基因（其捕获最大方差）在肝特异性基因（STable）上高度加权。正如预测的那样，当比较来自2名患者和其他细胞的3个候选CTC的比例表达值时，研究人员还在100个顶部差异表达基因中发现了许多肝脏相关基因。这些基因参与肝脏生理学，包括载脂蛋白，凝血因子，乙醇脱氢酶，细胞色素等。从这两个患者中分离的3个候选CTC共有12％的前100个表达基因（TTR，FABP1，GSTA1，APOH，FGB，HULC，ALB，APOA2，SEPP1，APOC1，HPD和ORM1），这增加了研究人员对高效CTC检测的信心。为了进一步支持这些异常细胞的肝谱系，研究人员对其缩放表达进行了基因集富集分析（GSEA），与所有其他细胞相比。胆汁酸和异生素代谢是这些细胞中最顶层的富集基因组。研究人员接下来试图基于它们的基因表达谱来表征其余的血细胞。使用定义这些簇中的每一个的标记基因，研究人员鉴定了与单核细胞，NK细胞，B细胞和T细胞，浆细胞样树突细胞和红细胞相容的细胞。
　　 CTC的表征和潜在的HCC驱动基因的鉴定。（A）在2名患者和其余血细胞中发现的3种CTC之间的差异基因表达的火山图。红点表示与FDR<0.05的比较。（B）条形大小代表归一化的富集分数值和FDR（即红色梯度），用于由GSEA产生的每个CTC中显着富集的基因组。（C）ASGR1在非CTC血细胞中的scRNAseq上的表达。缩放表达描绘为红色梯度（灰色表示没有检测到ASGR1的表达）。
　　 正如预测的那样，研究人员的CD45阴性选择使CTC与非CTC的比例增加至每~3,000个有核细胞约1个CTC。在这种情况下，高密度scRNA-seq对于使用全转录组数据准确区分CTC至关重要。出乎意料的是，当研究人员检查ASGPR1（一种用于检测HCCCTC的标记物）的表达时，研究人员发现它在很大比例的非CTC中表达，主要是单核细胞。最近已经描述了ASGPR1的非肝表达，这进一步强调了全基因组scRNAseq对精确CTC检测的附加价值。总之，这些观察结果进一步证明了用于CTC检测的单一（或靶向）标记物方法的局限性。总之，scRNAseq在HCC患者的血液中检测到具有高度暗示肝谱系的基因组谱的细胞。